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组织培养中防止污染的方法

   作者:zhuobo   发布时间:2021-01-19 19:11:23   浏览次数:2

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  (一)认真做好外植体的选择和消毒工作,防止外植体带菌

  对外植体的选择要考虑选择的时间和部位,尽量选取带菌少的材料,在时间上一般在植株的生长旺盛季节如春季和秋季病原微生物数量相对要少些,对于外植体的部位一般以幼嫩的部位较好。另外要做好外植体的消毒工作,目前外植体消毒常用药剂有:70%~75%的乙醇溶液,0.3%~0.6%的次氯酸钠溶液和0.1%的升汞溶液,选用何种消毒剂和消毒时间要根据外植体的幼嫩程度和部位确定,一般要求既将外植体表面的微生物杀死,又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。在生产实践中防止外植体污染,也可实行多次灭菌和交替灭菌相结合的办法,最终达到消灭杂菌的目的。

组织培养

  (二)改善接种室和培养室的环境条件,保证接种与培养环境清洁无菌

  与外植体自身带菌所产生的污染相比,操作污染和环境污染是可以克服的。在组培生产中,真菌的污染一般与环境有关,细菌污染与接种材料及工具有关。生产中要通过定期做好对接种室与培养室消毒工作,减少环境中的微生物数量,减轻对污染的危害,为此,在接种前接种室要认真做好消毒工作,且超净工作台在接种前,认真擦洗,紫外灯要开20~30min左右。培养室的相对湿度应控制在70%左右,对每件物品放到超净工作台上,都要用75%酒精认真擦洗一遍,方可放到台面上,只有这样在一定程度上可控制污染程度。

  (三)操作人员严格遵守无菌操作规程

  接种人员在接种操作中,应严格遵守无菌操作规范要求。接种人员的工作服、口罩、帽子等布质品要定期进行湿热灭菌,在超净工作台的操作区内,不要放入过多的待用物品,避免气流被挡住产生污染。定期清洗或更换超净工作台过滤器,接种前15~20min打开风机,风速调整到20~30m/min,并对台面用75%酒精喷雾消毒,工作人员进入操作室前必须对工作服、鞋帽进行消毒处理,进入接种室必须换上消毒过的鞋帽,接种前,接种人员必须认真洗手,还要用70%的乙醇棉球擦拭双手,只有接种过程中严格遵守操作要规范,才可避免因人为因素造成污染。

组织培养

  (四)培养基及接种工器具要严格灭菌,确保灭菌质量

  在对培养基和接种工具灭菌时,要先检查灭菌锅的使用情况,发现问题要立即检修。在灭菌过程中要绝对保证灭菌应达到的压力、时间,确保灭菌质量。一般要求压力应达到0.1个大气压,时间维持在15~20分钟,并且压力表降到零后不能马上出锅,防止外界环境的冷空气倒吸入已灭菌的培养瓶内引起真菌污染,应待锅内稍冷却后再出锅。对组培生产过程中培养容器封口采用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等材料,在使用前要认真做好清冼和消毒工作,不符合要求坚决不用。在分装培养基时,勿触瓶口,防止培养基粘在瓶口上,引起污染,瓶口封好后要检查封口是否破损,扎瓶口位置适当,松紧适宜。对已污染组培瓶要经高压灭菌后再清洗。

  (五)在培养基中加入适量的抗生素

  这是目前较常用的方法,抗生素可以直接加入到培养基中,也可以用抗生素喷洒或浸泡外植体。但植物种类不同,所用抗生素的种类、浓度和处理时间也不同,因此必须对不同植物采用不同的抗生素的种类、浓度和处理时间进行实验探讨。一般情况下,为消除革蓝氏阳性菌对有些木本植物污染茎段组培苗,可在培养基中加入四环素、头孢等混合物,可使细菌完全被消除。另外用头孢菌素Ⅱ消除某些观赏植物外植体中的内生菌也有非常明显的效果。

  (六)利用病毒在植株体内分布不均匀的原理,生产脱毒苗

  主要是针对在植物内部寄生的病毒,因病毒在生长点区域几乎不存在,且病毒也难以长到顶芽的分生组织,所以切取顶芽的分生组织进行组织培养,通过组织培养技术就可培养成无病毒植株,而且脱毒效果好,后代遗传性稳定,所以是目前生产无病毒苗最安全、最重要的一条途径。

  (七)利用培养基中高盐或高糖的浓度,抑制微生物的生长

  在培养基中有一些高盐或高糖的浓度可抑制微生物生长,或单宁酸存在时也可以达到抑制微生物生长的效果。

组织培养

  (八)减少培养基中的某些有机成分,可抑制微生物的生长养殖

  培养基中有机物如VB1、VB6、烟酸等有机成分,是某些细菌生长的必需物质,除去这些有机物后,细菌无法生长发育,逐渐死亡减少。这样也可在一定程度上减轻污染所带来的危害。

  总而言之,组培生产中污染的发生是不可忽视的环节,在生产过程中思想上要高度重视,行动上要有严格遵守操作规范,才能在一定程度上减轻污染所带来的危害。

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